La riqueza del krill antártico en ácidos grasos n-3 da a sus efectos nutricionales un interés particular por la acción antiaterogénica de éstos. El presente trabajo evalúa el efecto de la introducción del Krill total (10%), que aporta 230 mg/ día/ animal de ácidos grasos n-3, sobre la aterogénesis inducida por la dieta hipercolesterolémica en el conejo. Se estudiaron un grupo de animales B (n=5) alimentados con dieta hipercolesterolémica y otro C (n=5) con dieta hipercolesterolémica y krill al 10 %, y un grupo control A (n=5) con dieta equilibrada, durante 12 semanas. Se observó una disminución (p< 0,05) en la formación de placas de ateroma en las arterias pulmonares y reducción del contenido graso de las placas aórticas y pulmonares en los animales del grupo C, alimentados con krill. En otro estudio, un grupo de animales D (n=4) alimentados con dieta equilibrada después de una dieta hipercolesterolémica se comparó con otro grupo E(n=5) con dieta equilibrada y krill al 10 % tras una dieta hipercolesterolémica. Se demostró disminución de la extensión de las placas de ateroma (p< 0,05) con un menor contenido lipídico en los animales del grupo E, alimentados con krill. El krill antártico, por lo tanto, reduce los depósitos lipidíeos en la pared vascular modificando, además, la morfología y la constitución intersticial de las placas aorticopulmonares, efectos atribuibles fundamentalmente a su alto contenido en ácidos grasos n-3.

MODIFICATIONS OF EXPERIMENTAL AORTOPULMONARY ATHEROGENESIS IN RABBITS INDUCED BY THE INTRODUCTION OF KRILL (Euphasia Superba) IN THEIR DIET
The abundance of n-3 fatty acids in antartic krill has a special nutritional interest because of the antiatherogenic action of such acids. The present work evalúales the effect of introducing total krill (10%), supplying 230 mg/day/animal of n-3 fatty acids, on atherogenesis induced by a hypercholesterolemic diet in the rabbit. A group of animals B(n=5) given hypercholesterolemic diet and another one C(n=5) given a hypercholesterolemic diet plus 10 % krill, and a control group A(n=5) with a balanced diet, all for 12 weeks, were studied. We observed a decrease (p< 0,05) in the formation of pulmonary plaques and a reduction in the lipid contení of aorto-pulmonary plaques in the animals of group C, which were fed with krill. In another study of a group of animals D (n=4) given a balanced diet after a hypercholesterolemia diet and another group E (=5) fed a balanced diet and 10 % krill after hypercholesterolemia diet, a decrease in both the extent and the lipid content of plaques (p< 0,05) in the animals of group E, fed with krill, was observed. Antartic krill, therefore, reduces lipid deposits in the vascular wall; in addition, it modifies the morphology and the interstitial constitution of aorto-pulmonary plaques, effects which are fundamentally attributable to its high content in n-3 fatty acids.

INTRODUCCIÓN

El efecto antiaterogénico de los ácidos grasos poliinsaturados de la serie n-3 ha sido sugerido como causa de la baja prevalencia de enfermedades cardiovasculares en algunas poblaciones con hábitos alimentarios adfinidos 15. Este efecto es debido a sus acciones antitrombótica 6, antihipertensiva 7, hipolipemiante s y antiinflamatoria 9, explicadas a partir de cambios en el metabolismo lipoproteico y de los eicosanoides.
El krill (Euphasia Superba), pequeño crustáceo antártico de 3 a 8 cm. que representa una biomasa considerable 11,12, constituye una importante reserva proteica mundial 13,14. Actualmente el krill está disponible en diferentes formas para la alimentación humana, fundamentalmente con el objetivo de aportar proteínas 15. El alto contenido en ácidos grasos n-3 del krill antártico 16,17 agrega un interés nutricional suplementario a esta especie, pues sus presuntos efectos antiaterogénicos harían de él un alimento natural que podría contribuir a modificar el desarrollo e inducir la regresión de lesiones ateromatosas. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto del krill antártico sobre el desarrollo y la regresión de placas de ateroma ín vivo, en el conejo, animal utilizado frecuentemente en aterogénesis experimental inducida por dieta hipercolesterolémica i8,i9.

MATERIAL Y MÉTODOS

Animales utilizados

Se utilizaron 24 conejos albinos neozelandeses de 2,5 + 0,3 Kg. de peso, que fueron divididos en 5 grupos con dietas diferentes Grupo A, 5 animales con alimentación equilibrada para conejo (Villamil S.A. Montevideo, Uruguay); grupo B, 5 animales con alimentación equilibrada enriquecida con colesterol al 1% w/w; grupo C, 5 animales con alimentación equilibrada enriquecida con colesterol al 1 % w/w y krill al 10% w/w; grupo D, 4 animales con alimentación equilibrada, que habían recibido previamente durante 12 semanas alimentación equilibrada enriquecida con colesterol al 1% w/w, y grupo F, 5 animales con alimentación equilibrada y krill al 10 5 w/w, que habían recibido previamente durante 12 semanas alimentación equilibrada enriquecida con colesterol al 1% w/w.
Toda la alimentación fue suministrada en forma de peilets,ad libitum al igual que el agua. A las 12 semanas de instauradas las dietas, todos los animales fueron sacrificados;los animales de los grupos Dy E estuvieron con dieta 24 semanas, dado que recibieron 12 semanas de dieta previa con colesterol.

Estudio químico de la dieta

En los cuatro tipos de dietas utilizadas: 1) alimentación equilibrada; 2) alimentación equilibrada enriquecida con colesterol al 1% w/w; 3) alimentación equilibrada y krill entero al 10% y 4) alimentación equilibrada y krill entero al 10% w/w, enriquecida con colesterol al 1% w/w, se valoraron humedad, proteínas, lípidos, glúcidos, fibra, minerales, colesterol, energía y contenido en ácidos grasos saturados, monoinsaturados, poliinsaturados, y n-3. El porcentaje de humedad se calculó por doble pesada, hasta peso constante postsecado. Las proteínas se dosificaron por el método de Kjeldahl 20. Los lípidos fueron extraídos por el método de Folch con cloroformo/metanol v/v 21 y valoración por pesada, previa evaporación del disolvente. El contenido en fibra se calculó a través de la pérdida de peso por ignición del residuo seco remanente de una digestión ácida 22 y los minerales por el método de calcinación. Se adjudicó a los glúcidos la diferencia a 100 g de alimento.
El colesterol se determinó por el método enzimático de la colesterol-oxidasa-peroxidasa 23 en el extracto lipídico. La valoración de los ácidos grasos, en particular los de la serie n-3, se realizó por cromtaografía gaseosa, previa metilación del extracto lipídico con trifluoruro de boro metanol (Sigma), utilizándose como estándares complementarios, ácido octadecaenoico (ODA) C18; 46,9,12,15, ácido eicosapentaenoico (EPA), C20:5 5,8,11,14,17 y ácido docosahexaenoico (DEA) C22:6 4,7,10,13,16,19 (Sigma). Para la separación cromatográfica se utilizó un cromatógrafo de fase gaseosa Hitachi 263-50, en columna de vidrio de 2m x3mm de DI, empaquetada con succinato de dietilenglicol al 15% sobre Uniport (Cosukuw Kogys)" malla 60/80, a temperatura de 180°C, con un flujo de 45ml/min. de N2, en detector de ionización de llama 15.
La valoración se realizó por estimación de áreas utilizando un módulo integrador-computadora (Cromatopac) Shimadzu, modelo C-R S A.

Estudio bioquímico

Se extrajeron muestras de sangre por punción cardíaca a todos los animales tras la dieta, separando el suero por centrifugación y guardándolo a -20°C hasta su estudio.

Se determinó colesterol total (CT) por método enzimático 23 , tríglicéridos (TG) por método de separación de solventes 24 y colesterol unido a lipoproteínas de alta densidad (cHDL) por precipitación selectiva según la técnica de López-Virella 25,25 , utilizándose equipos de Laboratorio Wiener. El colesterol no unido a HDL se valoró por diferencia 27, : no cHDL=CT - cHDL.


Estudio Histológico

Tabla I - Composición de las diferentes dietas

Tabla 2-Lipidos plasmáticos después de las diferentes dietas en conejos

Se disecaron las arterias aorta y pulmonares de los conejos previa fijación en formalina, extendiéndolas sobre soportes de plástico. Se sometieron a tinción con solución alcohólica de Oil Red o in toto para observación directa de zonas lipídicas positivas en la superficie endotelial 28. La cara endotelial de las arterias, junto con una regla de referencia, fueron fotografiadas con lente macro, proyectándose la imagen sobre pantalla con papel cuadriculado, dibujándose el contorno de las arterias, de las áreas teñidas en rojo y de las zonas francamente elevadas del endotelio (0.1 mm o más). Se midieron las distintas superficies para expresarlas en porcentaje de superficie total de la arteria.
Se tomaron 3 secciones transversales de la aorta (área del cayado, sector medio y sector inferior) y una sección oblicua de la pulmonar, que fueron incluidas en parafina para ser cortadas a 6 u de espesor, realizando tinciones con Hemalum Eosina, PAS-Alcian Blue con digestión distásica, orceína para plástico y Wilder para fibras 28. Otras secciones transversales de las arterias, realizadas por micrótomo de congelación, fueron teñidas con Oil Red O-Hemalum para visualización de células con contenido lipídico.
En cortes transversales de las arterias teñidas con Hemalum Eosina y utilizando un ocular micromético, se realizaron medidas (3 por corte) délos espesores de la íntima arterial tomados exactamente a partir de la limitante elástica interna.
En los cortes transversales teñidos con Oil Red O, se calculó el espesor promedio ocupado por células nucleadas con contenido lipídico (macrófagos).

Métodos estadísticos

En todos los valores estudiados se utilizó para calcular la significación estadística el test de la t de Student para la comparación de grupos no apareados 29.
Los resultados de las dietas se expresan como medias de los cuadriplicados realizados en cada caso.

Resultados


Dietas

La composición de las diferentes dietas se muestra en la tabla 1. Destacan el mayor contenido en colesterol en las dietas 2 y 4, dietas enriquecidas con colesterol, y la presencia de ácidos grasos poliinsaturados n-3 en las dietas que contienen krill, dietas 3 y 4, en oposición a las dietas sin krill, 1 y 2. El aporte de ácidos grasos n-3 por las dietas 3 y 4 fue de 230 MG/día/animal; este valor se obtiene teniendo en cuenta que l00g de krill total contienen 1,47 g de n-3 (0,21 g de ODA;
0,80 g EPA; 0,46 g DEA) 13., que la ingesta mínima diaria del conejo es de 170 g/Kg. de peso y que las dietas contienen un 10 % de krill total (tabla I).

Estudios lipidíeos plasmáticos

En la tabla 2 se observan los resultados de los estudios lipidíeos plasmáticos; el CT aumentó significativamente (p<=0,001) en los grupos B y C en relación con el grupo A, a expensas del colesterol no HDL.

Estudios histológicos arteriales

Las medidas de la superficie porcentual ocupada por lesiones tingibles por Oil Red O y por lesiones elevadas en las arterias (figs. a y B) y pulmonar en los animales alimentados con dieta equilibrada revelaron lesiones mínimas, en general estrías lipídicas. En la tabla 3 se observa que no hubo diferencias significativas en cuanto a la extensión de las lesiones entre los animales que recibieron colesterol solamente (grupo B) y los que ingirieron simultáneamente krill (grupo C).
Sin embargo, en las arterias pulmonares, las placas presentan menor desarrollo en los animales que recibieron krill (grupo C).

Al examinar los cortes histológicos de las arterias pulmonar y aorta, se apreció en los animales alimentados con colesterol (grupo B) una proliferación intimal constituida fundamentalmente por macrófagos acompañados de una trama reticular escasa (fig.2).
Estos animales que recibieron krill junto con el colesterol (grupo C), a pesar de que las placas no mostraron diferencias.

Tabla 3 - Superficies porcentuales inedias de aorta después de la ingesta de diferentes dietas

Los resultados indicados con la misma letra en superindice presentan entre ellos una diferencia significativa con p<0,05. A: basal; B:colesterol al 1%; C:colesterol al 1%+krill al 10%; D:colesterol al 1% segudio de basal; E:colesterol al 1% segudio de krill nal 10%.

Significativas de espesor (tabla 4), el contenido lipídico tingible fue menor que en el grupo B y, además, las placas mostraron mayor fibrogénesis con una matriz mucoide relativamente alcianófila (fig 3 y 4). La menor cantidad de material tingible por Oil Red O es visible en la figura 1b, con una superficie endotelial aórtica de color naranja claro.
Las lesiones rojas y las placas fueron mayores (tablas 3 y 5) en los animales con continuaron con dieta equilibrada solamente (grupo D), en comparación con los que se sacrificaron tras 12 semanas de dieta con colesterol (grupo B), aunque el contenido lipídico con Oil Red O fue menor en los cortes del grupo D (figs.5-8). La sustitución se produjo según el aumento de cicatrices fibrosas que rellenaban las áreas necróticas centrales de la placa atermatosa. La necrosis detectada a través de la existencia de restos nucleares procedentes de la cariorrexis fue más frecuente en los grupos B y C.
El grupo E, que recibió krill después de la dieta hipercolesterolémica, presentó una menor extensión de lesiones pulmonares y aórticas que los que recibieron a continuación una dieta equilibrada - grupo D - (tablas 3 y 5 ), con dimensiones que permanecieron estacionarias en comparación con los animales de menor evolución del grupo B.
En los cortes histológicos, la reducción de macrófagos fue aún más notoria que en los animales del grupo D (figs. 5-8 ). El grosor de la íntima fue indiferenciable del grosor de la del grupo D, o incluso aumentó (tabla 4), al menos en la aorta.

Tabla 4 - Espesor medio de la íntima arterial (um) Después de la ingesta de diferentes dietas

A. basal; B: colesterol al 1%; C: colesterol al 1% + krill al 10 %, D: colesterol al 1% seguido de basal; E: colesterol al 1% seguido de krill al 10%. 'p< 0,05 entre los grupos D y E.

Tabla 5 - Superficies porcentuales medias de arterias pulmonares después de la ingesta de diferentes dietas

Los resultados indicados con la misma letra en superíndice presentan entre ellos una diferencia significativa con p<0,05.
A: basal; B: colesterol al 1 %; C: colesterol al 1% + krill al 10%; D: colesterol al 1% seguido de basal; E: colesterol al 1% seguido de krill al 10%.


Los lípidos fueron sustituidos por un aumento considerable de matriz intersticial alcianófila. En los cortes histológicos pudo apreciarse además que tanto el grupo E como el grupo D presentaban desarrollo del sector subendotelial de células musculares lisas bien diferenciadas, pero la magnitud de las capas formadas por aquellas, en general, paralelas a la luz y de distribución circular, fueron notoriamente mayores en el grupo E. En el grupo D resaltaba en cambio un casquete fibroso denso en la placa ateromatosa (fig.5).

Discusión

El efecto antiaterogénico de los ácidos grasos poliinsaturados n-3 ha sido postulado como explicación de la baja incidencia de afecciones cardiovasculares en algunas poblaciones humanas y animales 1-5-10, y corroborado de forma experimental en el conejo 31, con unas dietas cuyo contenido en ácidos grasos n-3 varía entre los 300 y los 900 mg al día por animal.
En el presente trabajo se ha recurrido a un alimento natural no preparado, el krill antártico (Euphasia Superba) el cual suministra por conejo una ingesta mínima de 230 mg de ácidos grasos n-3. Debe destacarse que el aumento de ácidos grasos n-3 en la dieta se expresa en todos los lípidos aciloides del organismo, como los fosfolípidos de membrana 32. Estos cambios tienen como consecuencia un aumento de la fluidez de las membranas que aumenta su resistencia a la lesión endotelial y al inicio de la formación de la placa de ateroma 33,34. El aumento de ácidos grasos n-3 en las membranas modifica su relación con los ácidos grasos poliinsaturados n-6, con el consecuenta predominio de las serie n-3 de los eicosanoides, tromboxano y prostaciclina, francamente antiaterogénico 35,36.
Debe tenerse en cuenta que la alimentación enriquecida con krill no modifica en la dieta base utilizada (dieta 1 de la tabla 1) el contenido global en proteínas, lipidos y minerales totales, puesto que el krill contiene valores semejantes a ella: 4,73 % de lípidos 19, 12-16 % de proteínas y 2,6-3,1 % de sustancias minerales 37. El aumento del colesterol en las dietas 2 y 4 se manifiesta por el aumento observado en el plasma de CT a expensas de la fracción no HDL, lo que corrobora lo descrito en la literatura 37,38,39. Para el estudio de la lesiones arteriales seleccionamos la técnica del estudio de la superficie de la íntima cuyos resultados han sido avalados previamente en el conejo por Duff et al 40. En las condiciones experimentales utilizadas, las lesiones aórticas y pulmonares inducidas por la dieta hipercolesterolémica (grupo B) fueron extensas y graves.
La mayor evolución de los grupos D y E, si bien permitió observar una disminución de los macrófagos intímales hasta valores del 5% de las concentraciones originales, dio lugar a un proceso de fibroplasia extensa o al depósito de colágeno joven de tipo alcianófilo, sin reducción de las lesiones elevadas o incluso con discreto aumento de su extensión.
Se considera la aterogénesis como un proceso fundamentalmente inflamatorio 41, sería necesario admitir que, una vez desencadenada, y aunque los factores nocivos cesen en su acción, se siguen produciendo fenómenos reparativos que incluyen la fibrogénesis y la proliferación de células musculares lisas diferenciadas o en fase sintética 42,43.
En primera instancia, la evolución de los animales con dieta hipercolesterolémica debería ser más prolongada, para permitir definir el destino final del proceso fibroplástico en la placa de ateroma.
La marcada extensión superficial de las lesiones arteriales inducidas con nuestro modelo reduce la sensibilidad del método de Duff et al 40 para permitir diferenciar el efecto de las dietas posteriores. De todas maneras el desarrollo más tardío y en menor extensión de las placas de ateroma en las arterias pulmonares del conejo (en comparación con la aorta) permite demostrar la menor extensión de las placas en los animales que reciben krill junto con colesterol (tabla 5).
La concentración de macrófagos disminuyó de manera franca en los animales tratados con krill (grupo C), tanto en la aorta como en la pulmonar, cuando se aprecian cortes transversales de las arterias con tinciones para lípidos. Tratándose de un alimento complejo esta reducción de los depósitos lipidíeos no debe ser atribuida solamente al contenido de ácidos grasos de la serie n-3, ya que el krill contiene además otras sustancias con un posible papel protector de la aterogénesis como ácido oleico, selenio y magnesio 43,44,45.
La menor proporción de lípidos con un espesor de las placas que no difirió significativamente entre los animales de los grupos B y C, fue sustituida en los animales que recibieron krill por la producción de una mayor cantidad de una matriz intersticial, finamente fibrilar y en parte amorfa, coloreable por el azul al cián, que se interpreta como colágeno joven neodepositado. Todo sucede como si la evolución natural de la placa se acelerara en la ausencia de la concentración masiva de macrófagos que enlentecen la fase de reparación con fibrogénesis de las células musculares lisas.
La evolución de las placas inducidas por el colesterol en la dieta fue también distinta en los animales que recibieron krill en comparación con aquellos que fueron sometidos secundariamente a una dieta equilibrada (grupos D y E). En este caso, en la aorta, la extensión de las placas y de los depósitos lipidíeos fue significativamente menor en los animales que recibieron krill. Otro tanto sucedió en las pulmonares con respecto a la extensión de los depósitos lipidíeos.
En los cortes histológicos de arterias de animales que evolucionaron con dieta equilibrada se apreció una peculiar estructura estratificada de las placas, con núcleos fibrosos densos y casquetes igualmente fibrosos. Los animales que recibieron krill mostraron menor cantidad de material lipídico, tanto libre como en macrófagos, ausencia de fibrosis densa y aparición de una matriz rica en material alcianófilo con proliferación superficial de células musculares lisas diferenciadas que sustituían el casquete fibroso de los animales del grupo D. La presencia de colágeno denso y no alcianófilo, de remodelación dificultosa, parece vincularse a las mayores evidencias de necrosis celular en los animales que no recibieron krill (grupo D).
Debe tenerse en cuenta que los ácidos grasos de la serie n-3 derivan la producción de leucotrienos, en las células macrofágicas, hacia la serie 5, con menor efecto agregante, quimiotáctico y vasoconstrictor que la serie 4 proveniente de los ácidos grasos n-6. De igual forma disminuye la síntesis de tromboxanos a expensas de la formación de tromboxanos A y B, con efecto antiagregante plaquetario, y los factores activador plaquetario, de crecimiento, de necrosis e interleucinas. Estas modificaciones constituirían la base fisiopatológica del efecto producido por el krill antártico sobre el proceso inflamatorio arteriosclerótico 32,46.